Процесс ферментации и экстракции ацилазы пенициллина

1,1. Ацилаза пенициллина и свои характеристики

Ацилаза пенициллина, также известная как аминогидролаза ацилазы пенициллина, или аминогидролаза ацилазы пенициллина. Оно главным образом получен от внутриклеточных энзимов Escherichia coli, внеклеточных энзимов Bacillus megaceus, и внутриклеточных энзимов Pichia pastoris. Он широко был использован в продукции важных промежуточных звен антибиотиков β-лактама и полусинтетических антибиотиков β-лактама. Ацилаза пенициллина фермент который специфически катализирует реакции пенициллина. Асилаза пенициллина главным образом использована в производственном процессе кислоты 6-аминопенисилланик (6-АПА). 6-АПА главным образом получено путем деасилатинг пенициллин г через ацилазу пенициллина. Кроме того, из-за антибактериальных, антигенных и аллергенных свойств пенициллинацилазы трудно разлагается ферментами в бактериальных клетках; кроме того, из-за легкого образования остатков антибиотика β-лактама пенициллинацилазой и проблемы канцерогенности, Лечение и контроль таких веществ всегда были сложной проблемой в области исследований антибиотиков.

1,2. Что такое ациляция?

Ациляция также называется ацилирование. Ацилирование относится к реакции введения алифатического ацила RCO-или ароматического ацила ArCO-в атомы азота, кислорода, углерода или серы в органических молекулах. Продуктами после ациляции являются такие соединения, как кетоны (альдегиды), амиды и сложные эфиры. Реакции ациляции можно разделить на ациляция кислорода, ациляция азота и ациляция углерода в зависимости от места введения ацила. Ацилиирующие агенты обычно представляют собой карбоновые кислоты или производные карбоновых кислот. Реакции ациляции также могут быть классифицированы в соответствии с типом ацилиирующих агентов.

2 Метод извлечения ацилазы пенициллина

Как перерабатывать и очищать пенициллинацилазу, особенно с использованием Escherichia coli или Pichia pastoris для генной инженерии. Это очень важное звено, и этот шаг оказывает большое влияние на качество пенициллинацилазы.

2,1. Ультразвуковое нарушение. Хроматография

Ультразвуковое разрушение, хроматография и экстракционная очистка обычно используются методы биосепарации, которые можно использовать для разделения, очистки и извлечения биомакромолекул, таких как белки и нуклеиновые кислоты. Весь процесс обычно унесен на низкой температуре (0 ~ 4 ℃) для избежания ухудшения и повреждения образца. В этом исследовании Escherichia coli использовалась в качестве основных генетически модифицированных бактерий для экстракции сырой ферментной жидкости. Удаление клеточной стенки, нуклеиновой кислоты и липидных частей в экстракте может сделать целевой белок более чистым и стабильным. Чтобы получить лучшие результаты, в исследовании были приняты различные эффективные методы очистки, такие как метод сегментированного седиментации сульфатом аммония, метод хроматографической колонки, метод проектирования пищевых волокон DAE-52-колоночная хроматография, гелевая колоночная хроматография и т. Д. Исследования показали, что специфическая активность сырого ферментного раствора кишечной палочки бедна, И вообще необходимы 4 до 5 этапов очищения для того чтобы получить более высокую специфическую деятельность. Ультразвуковой задавливать, хроматографию и технологию очищения извлечения можно эффектно использовать для того чтобы очистить незрелое решение энзима Эшеричя коли, обеспечивая надежную основу для последующих функциональных исследования и применения.

2,2. Ударное осмотическое давление

Импульсная технология высокого давления широко используется при экстракции и очистке биомакромолекул. Ацилаза пенициллина является внутриклеточной протеазой, в основном распределенной по клеточной мембране и клеточной стенке, и часто используется при приготовлении антибиотиков. В этом исследовании ацилаза пенициллина была извлечена по импульсной технологии высокого давления, и полученный сырой раствор фермента имел более высокую активность. Посредством осаждения водным раствором сульфата аммония за один раз может быть получена более высокая скорость реакции, и ее можно непосредственно применять для иммобилизации. Для эффективного извлечения пенициллинацилазы в исследовании использовался метод осмотического давления, который является простым и легким методом экстракции, который не требует слишком большого количества инструментов и имеет широкий спектр применения. Этот метод смачивает кишечную палочку в гипертоническом растворе, а затем перемещает ее в гипотоническую среду. Благодаря действию осмотического давления клеточная стенка разрывается и фермент выводится из организма. Этот метод может предотвратить проблему чрезмерного высвобождения содержащихся веществ из-за полного разрыва и эффективно поддерживать выживаемость бактерий. После получения сырого фермента его можно очистить такими методами, как осаждение сульфата аммония и анализ колоночной хроматографии для получения фермента электрофореза полиакриламидного геля с однополосной структурой. Именно из-заМетод воздействия осмотического давления заключается в том, что целостность клеточной стенки и выживаемость бактерий поддерживаются во время процесса экстракции, тем самым получая сырой ферментный раствор с более высокой удельной активностью. Кроме того, этот метод экстракции также помогает сохранить структуру ферментной полосы, тем самым помогая получить высокочистую, высокоспецифическую активность пенициллинацилазы.

2,3. Адсорбент лечение

Ацилаза пенициллина важный энзим и имеет важное значение применения в подготовке антибиотиков. В этом исследовании, для того чтобы отделить ацилазу пенициллина от бульона заквашивания, метод адсорбции был использован для разъединения. Используя окисоводопод аммония для того чтобы обработать диатомовую землю смогите сразу извлечь ацилазу пенициллина, и работать на комнатной температуре, с высоким выходом деятельности при энзима и хорошими перспективами промышленного применения. Для сбора бактерий потребление энергии методом центробежного разделения является высоким из-за небольшого размера микроорганизмов и трудности в осаждении. Кроме того, метод одиночного флокуляции не может полностью собрать бактерии. Таким образом, комбинация флокулянтов и технологии центрифугирования может быть использована для сбора бактерий для повышения эффективности сбора и снижения центробежного потребления энергии. Существует множество факторов, которые влияют на активность ферментов во время производства и экстракции пенициллинацилазы, таких как тип, концентрация, температура и т. д. растворителей. Метод регулировки дозировки и значения pH экстрагированного фермента также очень важен. Обычно ферментационный бульон можно предварительно обработать, чтобы максимизировать ферментную активность, а затем добавляется адсорбат и пенициллинацилаза отделяется. Этот метод может сделать продукцию и разъединение ацилазы пенициллина более эффективным и стабилизированным.

3 Процесс ферментации ацилазы пенициллина

3,1. Приготовление спор

Для улучшенных штаммов из песчаной почвы генетическое улучшение может быть проведено с использованием культуральных сред, содержащих глицерин, глюкозу, белок и т. Д. В условиях оптимальной температуры роста 25-26 ℃ и 6-8 дней можно получить одиночные колонии и можно проводить наклонное размножение, А наклонные споры можно получить через 7 дней. Эти споры могут быть пересажены в высококачественную зерновую или рисовую твердую культурную среду, а культура проса с 3 стадиями роста в течение 7 дней при 25 ℃ должна добавить больше источника углерода и источника органического азота для получения большого количества гиф. Для спор, образующихся во время процесса ферментации, эксперименты с встряхиванием колб должны проводиться для проверки эффективности и состояния чужеродных бактерий. Кроме того, в процессе выращивания семенных резервуаров и ферментационных резервуаров необходимо получить большое количество гиф путем добавления источника углерода и источника органического азота. Процесс заквашивания для продукции пенициллина Во время заквашивания ацилазы пенициллина, содержание растворенного максимумом кислорода и тариф вентиляции необходимы, и тариф воздушных потоков обычно 1:1 ~ 1:5. Скорость перемешивания должна быть умеренной, обычно 150 ~ 200 об/мин. На ранней стадии ферментации мощность перемешивания велика, что может способствовать росту бактерий. Кроме того, контроль таких параметров, как время и температура на каждой стадии ферментации, также необходимо регулировать в соответствии с различными штаммами и условиями ферментации. Ферментационный резервуар является основным звеном в крупномасштабном производстве ацилазы пенициллина. В ферментационном резервуаре можно добавить различные вещества, такие как порошок арахисового пирога, порошок отрубей, кукурузный сироп, глюкоза, мочевина и т. Д., Для улучшения состояния питания и скорости роста бактерий. При инокуляции рекомендуется контролировать количество инокуляции мицелия от 12% до 15%, чтобы избежать отходов и снизить затраты. Кроме того, при обращении с жидкостью, образующейся в процессе ферментации, следует уделять внимание охране окружающей среды. Неныжная жидкость может содержать различные вредные вещества и загрязняющие вещества, которые необходимо строго обрабатывать и сбрасывать.

3,2. Контроль ферментации ацилазы пенициллина

Процесс подготовки ацилазы пенициллина получил ацилазу пенициллина под подходящей культурной средой, температурой, вентиляцией и перемешиванием условий культуры. Перед ферментацией дезинфицируются соответствующее оборудование и среды (в основном источник углерода, источник азота, прекурсор и неорганическая соль), а затем подключается семенная жидкость. В этот период, чтобы поддерживать определенную температуру и давление, часто добавляют пеногасители. Если значение pH ферментационной жидкости контролируется кислотой и щелочью, то глюкоза и соли аммония должны добавляться периодически или непрерывно для дополнения источника углерода и источника азота или должны добавляться другие жидкие прекурсоры для увеличенияВыход ацилазы пенициллина.

3,3. Характеристики процесса заквашивания ацилазы пенициллина

В процессе производства ацилазы пенициллина сахарный раствор является одним из основных питательных веществ, а содержание сахарного раствора может напрямую влиять на производство и выход ацилазы пенициллина. Если скорость добавления сахара слишком низкая, скорость роста мицелия уменьшится, что повлияет на активность и выработку бактерий, в то время как высокое соотношение сахара приведет к увеличению вязкости ферментационной жидкости, увеличению количества мицелия и быстрому снижению растворенного кислорода, Влияет на нормальный ход ферментации. Поэтому, для того чтобы произвести эффективную ацилазу пенициллина, содержание раствора сахара необходимо точно контролировать. В настоящее время обычно используется определенная кривая содержания сахара, которая основана на экспериментальных данных и была оптимизирована и улучшена. Однако, поскольку сырье каждой партии продукции отличается, а характеристики разнообразия каждой партии различаются из-за разных зародышевых плазм, если для добавления используется только одна и та же кривая содержания сахара, некоторые продукты будут иметь недостаточный выход. Поэтому, как точно отрегулировать содержание сахара в соответствии с метаболическим статусом мицелия, является одним из ключей к контролю процесса производства пенициллинацилазы. Различные кривые содержания сахара могут быть использованы для корректировки в соответствии с метаболическим статусом мицелия. Когда количество мицелия невелико на ранней стадии ферментации, скорость добавления сахара в сахарный раствор можно постепенно увеличивать, чтобы ускорить темпы роста мицелия. В то же время на средних и поздних стадиях ферментации следует контролировать содержание сахарного раствора, чтобы избежать чрезмерного накопления сахара, влияющего на нормальный метаболизм ферментационной жидкости. Кроме того, кривую содержания сахара можно динамически регулировать в соответствии с обнаруженным в реальном времени содержанием раствора сахара, чтобы более точно контролировать содержание раствора сахара.

4 Процесс извлечения ацилазы пенициллина

4,1. Предварительная обработка

После завершения ферментации он существует в ферментационных бульонах Monascus в виде минимальной интенсивности 10 ~ 30 кг/м3, который содержит большое количество неорганических ионов с высоким содержанием кислорода (Ca, Mg, Fe), мицелий, неиспользованная питательная среда, легко загрязненные клетки, метаболиты патогенов, белки, И т. д. Его основное назначение-обогащение целевого продукта и удаление большого количества примесей для дальнейшего разделения и очистки.

4,2. Фильтрация

Ферментационный бульон необходимо предварительно обработать перед экстракцией. Небольшое количество флокулянта (например, квасцов) можно добавить в ферментационный бульон, или значение pH ферментационного бульона можно отрегулировать до изоэлектрической точки белка для осаждения белка, А затем плавающая жидкость закачивается в каждую герметичную фильтрующую камеру фильтра через вакуумный барабан (с использованием отрицательного давления в качестве мощности фильтрации) или плоский фильтрующий картридж. Под рабочим давлением происходит разделение твердого вещества и жидкости через фильтрующую мембрану или другие фильтровальные коржи. Поскольку ацилаза пенициллина легко разлагается при комнатной температуре, температура ферментационного бульона и фильтрата ниже 10 ° С, а ее выход выше 90%.

4,3. Добыча

Ацилаза пенициллина была изолирована от ацилазы пенициллина растворяющей экстракцией. Это метод концентрирования и очистки антибиотиков из одной жидкой фазы (например, ферментационный фильтрат) в другую жидкую фазу (например, органический растворитель) в различных условиях рН, в различных химических состояниях (свободная кислота или соли), в растворителях, которые нерастворимы в воде. Поскольку в структуре молекул пенициллинацилазы имеется карбоксильная группа и ее pKa составляет 2,75, свободная кислота образуется, когда ее водный раствор подкисляется до значения pH около 2,0. Кислота ацилазы пенициллина имеет весьма низкую растворимость и хорошие растворяющие свойства извлечения в спиртах, кетонах, эфирах, эфирах, етк., поэтому ее можно отделить и очистить от бульона заквашивания.

Ацилаза пенициллина переносится в органический растворитель в кислой среде, значение pH регулируется примерно до 2,0, а затем переходит в нейтральную водную фазу, многократно экстрагируется и, наконец, очищается. Обычно используется ацилаза пенициллина с более высоким коэффициентом распределения. Бутилацетат и н-пентил ацетат в основном используются в промышленном производстве. PH бутилацетата, извлеченного из ферментационного бульона, составляет 1,8 ~ 2,0, а значение pH бутилацетата, извлеченного обратно в водную фазу, составляет 6,8 ~ 7,4. Экспериментальные результаты показывают, что отношение фильтрата брожения к раствору бутилацетата составляет 1,5 ~ 2,1. Сульфатные и карбонатные буферные растворы являются намиEd для обратной экстракции для предотвращения колебаний pH. Соотношение ферментационного бульона к раствору составляет 3 ~ 4. После нескольких экстракций и 10 концентраций его концентрация в основном соответствует условиям кристаллизации, а общий выход экстракции достигает 85%. Полученный просеивающий раствор в основном является вторичной экстракцией с использованием 10% раствора серной кислоты с pH 2,0 ~ 3,0, а затем добавляется бутилацетат, количество которого составляет около 1/3 просеивающего раствора, и обратное извлечение обычно унесено с водным раствором гидрокарбоната натрия с пэ-аш 7,0 ~ 8,0. Во время первичного процесса экстракции, из-за высокой концентрации белка в фильтрации, необходимо добавить деэмульгатор. Первым шагом является экстракция, содержащая белок, и добавление PPB 0,05% ~ 0,1%.

4,4. Добыча

Для того чтобы уменьшить ухудшение ацилазы пенициллина, его необходимо унести на низкой температуре под 10 ℃. -Рассол в экстракционной емкости замораживается. Во время экстракции температура и кислотность оказывают большое влияние на деградацию пенициллинацилазы, что является важным фактором, влияющим на ее деградацию. Многие ученые провели множество исследований по этому вопросу, и провели детальное обсуждение влияния температуры сточных вод и влажности различных значений рН на период его распада. Результаты показывают что ряд стабильности ацилазы пенициллина пэ-аш 5,0 ~ 8,0, и он показывает сильную стабильность на пэ-аш 6,0, и его можно быстро разлагать и в кисловочных и алкалических условиях. Посредством подгонки кривой, связь между периодом полураспада пенициллинацилазы при различных температурах и значением рН получается.

4,5. Кристаллизация

Активированный уголь добавляется в экстракт для удаления пигментов, источников тепла, фильтрации и удаления активированного угля. Экстракт, как правило, очищается путем кристаллизации. В бутилацетате, в виду того что растворимость соли калия ацилазы пенициллина очень низка, соль калия ацилазы пенициллина выкристаллизуется после добавления ацетат-этанола калия. На этой основе калий растворяется в водном растворе KOH с помощью метода перекристаллизации, значение pH регулируется до нейтрального, добавляется бутанол, и, наконец, чистый продукт получают через азеотропную дистилляцию. (1) Метод прямой кристаллизации: бутилацетатный экстракт реагирует с ацетатом натрия-этанолом для получения кристаллической натриевой соли. Калийную соль ацилазы пенициллина получают путем смешивания ацетата калия-этанола-ацетата калия. (2) Азеотропный метод дистилляции: после экстракции, он извлекается с 0,5 моль/л гидроксида натрия и значение рН регулируется до 6,4 ~ 6,8 для получения натрия-содержащих физиологических солевых. При 16 ~ 26 ℃ и 0,67 ~ 1,3 кПа добавляется 2,5 раза бутанол. Вода и n-бутанол испаряются азеотропным способом. Кристаллы ионов натрия осаждаются. Кристаллы промывают и сушат для получения продуктов ацилазы пенициллина.